医药学论文：谈乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

1 材料和方法
1.2 方法
1.2.2 pAdTrack-CMV-HBX与pAdEasy的同源重组 将正确重组的穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx用PmeⅠ酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用PacⅠ酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态DH5α细菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒pAd-HBx。
1.2.4 重组腺病毒Ad-HBx目的基因鉴定 5 μl病毒上清液加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1 h，然后煮沸样品5 min，离心后取1～2 μl进行PCR反应，证实重组腺病毒基因组中含有HBx基因。
2.1 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx的鉴定 用HindⅢ/EcoRⅤ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用HBx基因全序列的上下游引物其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465 bp的条带，与目的基因HBx的DNA片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx中HBx的碱基序列与文献报道一致。
2.3 重组腺病毒Ad-HBx的包装 含重组腺病毒的质粒pAd-HBx转染包装细胞293，在24～48 h后，荧光显微镜下可观察到GFP的表达(图2)，表明重组腺病毒在293细胞中已开始病毒包装。7～10天后可观察到细胞病变(CPE)，大部分包装细胞肿胀脱落。
3 讨 论
本实验采用限制性内切酶从重组质粒pcDNA3.1-HBx得到HBx基因，应用pAdEasyTM重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌BJ5183内进行同源重组， 大大提高了病毒的重组效率。AdEasyTM重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完整的腺病毒基因，缺失E1区(1-3533)和E3区。E1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充E1区。重组穿梭质粒含有目的基因HBx基因、CMV启动子、GFP基因、卡那霉素(Kana)耐药基因、限制性内切酶PacⅠ位点和PmeⅠ位点。将穿梭质粒用PmeⅠ酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌BJ5183中进行同源重组，利用卡那霉素抗性筛选重组体。重组成功的质粒用PacⅠ线性化，转染293细胞，得到可表达HBx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中GFP的表达情况，检测HBx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒Ad-HBx构建成功。本实验构建的携带HBx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(GFP为报告基因)的优点，为下一步研究HBx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立基础。