医药学论文：浅论松果体褪黑素对大鼠下丘脑CRH神经元的影响

1 材料与方法
1.1.1 分组 选用2月龄雄性清洁级SD大鼠100只（浙江省实验动物中心，合格证书号：2001001），体质量(200±10）g。标准颗粒饲料，自由摄食饮水，自然光照。随机分为对照组（N组）、假手术对照组（Sham组）、松果体摘除组（M0组）、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组（M1组）和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组（M2组），注射时间为每天17∶00，注射后4，8周取材，M0组动物腹腔注射等量生理盐水。
1.2 方法
1.2.2 下丘脑CRH原位杂交 随机选取每只动物室旁核后部3张切片行原位杂交检测CRH mRNA，杂交过程参见试剂盒说明。主要步骤为：3%H2O2 10 min，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶10 min,PBS洗后入预杂交液40 ℃ 3 h,入杂交液（含CRH寡核苷酸探针）40 ℃过夜，SSC洗涤后加封闭液37 ℃ 30 min,入生物素化鼠抗地高辛37 ℃ 1 h，PBS洗后入SABC 37 ℃ 20 min，PBS洗后加生物素化过氧化物酶37 ℃ 20 min，PBS洗后DAB显色5 min,常规脱水透明封固。以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。
1.2.4 显微摄像及图像处理分析 将免疫组织化学和原位杂交所获得的切片运用数字显微摄像系统进行拍照并运用图像分析软件进行定量检测。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件。数据行方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析。P< 0.05为差别有统计学意义。
2.1 松果体摘除及应用外源性褪黑素后下丘脑室旁核CRH神经元转录水平的变化 各组的CRH阳性细胞主要分布于室旁核后部背内侧小细胞亚核，即后大细胞亚核与第三脑室之间的区域。M0组的外侧小细胞亚核和腹内侧小细胞亚核也出现了不少阳性细胞。CRH阳性细胞形态多样，以梭形为主，发出若干突起，免疫反应物均匀分布于胞质中。M0组与N组和Sham组相比，CRH阳性细胞数增加，阳性面积增加，平均灰度降低（P< 0.05），补充褪黑素后呈剂量依赖性恢复，M2组与M0组相比差别有统计学意义（P< 0.05），阳性细胞主要局限于背内侧小细胞亚核和腹内侧小细胞亚核，但无论是M2还是M1组上述指标与Sham组相比差别有统计学意义。N组与Sham组比较差别无统计学意义，术后4周与术后8周的结果差别无统计学意义（图1，表1）。