医药学论文：探析BrdU标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用

摘要： 目的: 探讨大鼠睾丸支持细胞原代培养5溴2脱氧尿苷（BrdU）的最佳标记时间、 剂量。方法: 大鼠睾丸支持细胞进行体外原代培养; 以终浓度分别为5、 10、 15、 20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量; 在细胞培养的12、 24、 36、 48 h掺入BrdU, 使终浓度为15 μmol/L, 测定BrdU的最佳标记时间; 免疫细胞化学法跟踪观察大鼠睾丸支持细胞在体外培养中的分化 发育情况和BrdU标记率。结果: 免疫组化检查提示最终浓度为15 μmol/L和孵育36 h BrdU标记率均>90%, 并且连续传3代均可检测到。结论: 终浓度15 μmol/L及孵育36 h为BrdU标记睾丸支持细胞的最佳剂量及时间, 表明BrdU 标记可用于睾丸支持细胞体内后的存活、 生长的动态观察。

关键词： 睾丸支持细胞 体外培养 BrdU

1 材料和方法
SD雄性大鼠（体质量约100 g, 17～22 日龄）购于第四军医大学动物试验中心; DMEMF12培养基、 优质胎牛血清购自Gibco公司, 胶原酶、 胰酶、 BrdU购自Sigma公司; 抗 BrdU抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.2.1 大鼠睾丸支持细胞体外分离培养
集细胞, 用含100 mL/L胎牛血清的培养液洗3次（900 r/min, 3 min）, 稀释细胞至1.5×109/L, 接种于25 cm2塑料培养瓶。34℃、 CO2培养箱中50 mL/LCO2培养48 h, 于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况（图1）, 吸去培养液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl缓冲液低渗处理3 min后, 用培养液洗涤2次, 洗去大部分生精细胞。加入含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养, 逐日更换培养液并进行观察。
将培养的支持细胞用2.5 g/L胰酶消化并洗涤后, 接种到1个6孔板中, 并在6孔板中各孔加入1块经多聚赖氨酸包被的盖玻片, 将细胞放入培养箱中继续培养, 待细胞生长于载玻片后, 将载玻片取出, 在Carnoy中固定12 min。950 mL/L、 700 mL/L乙醇、 蒸馏水及盐酸分步漂洗; 置于60℃的1 mmol/L HCl 12 min后在冷盐酸中漂洗; chiff试剂内2 h; 入100 mL/L偏重亚硫酸钠溶液除去非特异染色后, 经自来水、 蒸馏水、 700 mL/L、 950 mL/L及1000 mL/L乙醇分步洗涤, 固绿染色; 显微镜下观察并摄片（图1）。收集培养6～8 d的支持细胞, 在25 g/L戊二醛固定液中预固定, 经锇酸后固定、 脱水、 包埋、 半薄切片定位、 超薄切片等步骤后, 在JEOL JEM1220透射电子显微镜下观察其超微结构。
每日观察细胞生长情况, 绘制大鼠睾丸支持细胞生长曲线。以1×105/L将睾丸支持细胞接种于爬片处理的6孔板中, 并以终浓度分别为5、 10、 15、 20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量; 在细胞培养的12、 24、 36、 48 h掺入BrdU, 使终浓度为15 μmol/L, 测定BrdU的最佳标记时间; 设定正常对照组观察BrdU有无细胞毒性。随机数取10个非重叠视野（×100）, 计算BrdU 阳性细胞占总细胞数的比例。
具体步骤如下: （1）PBS清洗标本3 次各1 min; （2）40 g/L多聚甲醛固定30 min, PBS冲洗5 min, 3次; （3
1.2.5 对照试验
1.2.6 统计学处理
2 结果
单个睾丸支持细胞悬液接种于25 cm2塑料培养瓶,支持细胞贴壁性比较强, 培养24 h之后, 大多数细胞开始贴壁, 培养液中漂浮着较多生精细胞。培养48 h之后, 胞质逐渐增多, 折光性减弱。3～4 d后支持细胞胞质铺展, 细胞间隙变小。4～6 d后胞质完全铺开, 细胞相互连接, 铺展成膜状单层。吸去培养液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl缓冲液低渗处理3 min后, 用培养液洗涤2次, 洗去大部分生精细胞。