医药学论文：论体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立

1 材料和方法
1.2 方法
1.2.2 细胞转染及鉴定 参照说明书应用阳离子脂质体Lipofectin将pcDNA3GFPHER2转染入小鼠黑色素瘤细胞系, 转染后的细胞用含200 mL/L FBS IMDM（IMDM完全培养液）稀释, 按每孔0.2个细胞/100 μL铺96孔平底培养板, 37℃、 5 mL/L CO2孵箱中培养。次日, 每孔补加100 μL含1 600 mg/L G418的IMDM完全培养液, 1 周后用含800 mg/L G418的IMDM完全培养液换液。2 周后在共聚焦荧光显微镜下观察, 选择细胞状态好、 荧光强、 呈单集落生长的细胞进行扩增, 即获得GFPHER2表达阳性的B16细胞。将上述细胞经过液氮冻存、 37℃水浴复苏和连续传代培养2 周后, 用共聚焦荧光显微镜和FCM在蛋白水平上检测GFPHER2的表达。参照TRIzol试剂说明书提取转染细胞的总RNA, 逆转录后进行PCR反应, 检测HER2基因mRNA的表达（上游引物: 5′CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3′; 下游引物: 5′GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA3′）。

2 结果
2.2 转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞鉴定 阳离子脂质体转染法将pcDNA3GFPHER2重组质粒转染B16细胞, 通过G418压力筛选及有限稀释法进行筛选和克隆化, 得到1株转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞, 命名为B16/HER21。经RTPCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定, 得到344 bp的HER2特异性条带（图2A）。