摘要： 目的: 制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定与应用。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定, 通过免疫沉淀联合质谱、 UniZAP XR表达文库筛选鉴定抗原, 借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物。结果: 获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb 的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）, 该 mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化、 免疫荧光染色、 免疫沉淀实验和复合物的分离。结论: 成功制备了抗人CPSI的mAb, 为CPSI的研究提供了有力的工具。
关键词： 氨甲酰磷酸合成酶(CPSI) 单克隆抗体 特性
1 材料和方法
免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂购自Sigma公司; 羊抗鼠IgGHRP购自中山公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱购自Amersham公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜购自Amersham公司; ECL反应试剂盒购自Amersham公司; 半干转印仪购自BioRad公司; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备
1.2.2 鼠抗人mAb的制备
。
(1)抗原的质谱鉴定: 应用mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行SDSPAGE电泳, 根据Western blot结果显示的阳
1.2.4 mAb的鉴定
2 000稀释的mAb, 室温下孵育2 h, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗3 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL, 室温孵育15 min, 滴加H2O2甲醇, 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭20 min, 加入1∶100稀释的鼠抗人CPS1 mAb, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。(3)免疫荧光染色: 取liver carcinoma cells (HCV)细胞, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液, 将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养1～3 d, 待细胞接近长成单层, 加入适当稀释的罗丹明123, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养30 min, 取出盖玻片, 浸入PBS（0.01 mol/L, pH7.4）,
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