医药学论文：探讨转基因显微注射中的基因装液方法改良

摘要：目前常用的转基因动物制备方法有显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法及电转移法等[16]。其中显微注射仍是最可靠、最广泛使用的一种方法,因其外源基因整合效率高,对目的基因无大小限制,且可以直接获得纯系[78]，但其过程烦琐且要求严格,将基因液装入微注射针是其成功的关键前提[910]。当前各实验室普遍使用可编程微量注射仪,该仪器要求将基因液面倒吸至注射针的直管部以获得稳定平衡压力,但仅用其吸入功能无法达到,导致培养液倒吸,基因液被稀释,从而大大影响了转基因成功率。笔者建立一种简单有效的方法以克服这一缺点。

 

关键词： 动物 遗体修饰 小鼠 转基因 显微注射 基因转移技术

1.1 仪器和材料 PN30拉针仪,MF900煅针仪,IM300可编程微量注射仪（日本Narishige公司）；倒置显微镜,显微操作仪（日本Olympus公司）,G100薄壁毛细玻璃管（1×90 mm,日本Narishige公司）或BJ40薄壁毛细玻璃管（1.0×100 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,玻璃管（2.5×200 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,一次性培养平皿（美国BD FALCON公司）,显微注射用基因液,M2培养液,石蜡油（M8410,美国Sigma公司）。
1.2.1 注射针 拉针仪：主磁61，副磁23；温度70 ℃；煅针仪：弯针温度20～25 ℃。
1.3 方法
1.3.2 微载管制备 用两把镊子夹住直径为2.5 mm的玻璃管两端,将其中部置于酒精灯火焰上灼烧,待其软化后,快速向外拉伸。在距肩部约9～10 cm处用砂轮裁断细部,将细部的尖端在锻针仪上锻烧,使开口边缘变光滑。这样制备的微载管外直径约200～400 μm,用于将石蜡油装入显微注射针。
1.3.3.1 针尖倒吸法（A法） 将注射针装到显微操作仪持针器上,并与可编程微量注射仪相连接,调好可编程微量注射仪各部分参数,打开"BALN"功能；在培养皿盖子上作一个3 μL基因液液滴,覆盖上石蜡油,将其置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,使其进入基因液滴,按下注射仪的"FILL"按键,将基因液倒吸进入注射针,按下注射仪的"FILL"按键数次,观察注射针内液面的变化。
图1 显微注射针各部分示意图（略）
1.3.4 显微注射模拟及比较
1.3.4.2 模拟注射后液面变化 保持显微注射仪所有参数不变,调好注射仪的"INJ"功能,反复按压"INJ"按键模拟显微注射过程＞30次后,按压"CLR"按键10次,在倒置显微镜20×物镜下观察注射针内液面变化情况。
2 结果
2.2 显微注射模拟及比较
2.2.2 模拟注射后液面变化 反复按压"INJ"按键模拟显微注射过程＞30次后,按压"CLR"按键10次,在倒置显微镜20×物镜下观察,用A法装载的基因液液面缓慢上升,M2培养液倒吸进入注射针；用B法装载的基因液界面仍然缓慢下降。