医药学论文：探析人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

1 材料和方法
1.2 MASP1N端片段原核表达载体的构建 设计1对特异引物:上游引物序列为5′GCGAATTCCACACCGTGGAGCTAAAC3′, 含有EcoRⅠ酶切位点; 下游引物序列为 5′GCCTCGAGCATTTCCTGCAGCCCTGTATG3′, 含有XhoⅠ酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pGEMMASP1质粒为模板, 采用上述引物扩增MASP1N端包括2个CUB区和EGF区的编码基因片段（长度857 bp, 编码280个氨基酸）, 以PCR产物回收试剂盒回收扩增产物, 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切MASP1N端基因片段和pGEX4T1质粒DNA, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶回收试剂盒回收各片段, 以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态TOP10F′大肠杆菌, 涂菌液于含100 mg/L 氨苄青霉素的LB平板中, 挑取单个菌落, 接种于含氨苄青霉素的LB培养液中, 37℃振荡培养12 h。提取质粒, 以限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定, 并进行DNA序列测定（由上海博亚公司完成）。鉴定正确的质粒命名为pGEX4TMASP1N。