医药学论文：论TSA对甲状腺鳞癌细胞株SW579增殖的影响

1 材料与方法
TSA (SIGMA公司)用二甲基亚砜（DMSO）充分溶解，配成4×10-4 mol/L的贮备液，-20 ℃避光保存。使用时用细胞培养液稀释到所需浓度。AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司；L15培养液(SIGMA公司产品)按照说明用三蒸水配置，100 U/mL青霉素、100 μg/mL的链霉素，调整pH值至7.0～7.2，0.22 μm微孔滤器无菌过滤，4 ℃冰箱保存。使用前加入10% 的胎牛血清。四甲基偶氮唑蓝（SIGMA公司）；倒置显微镜(JAPAN OLYMPUS TOKYO)、流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)、荧光显微镜(JAPAN OLYMPUS TOKYO)L15培养液（SIGMA公司）；Multiskan Ascent自动酶标检测仪。
甲状腺鳞癌细胞株SW579购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。该细胞株在L15培养液中、饱和湿度、37 ℃、无CO2 孵箱中培养。当细胞汇合至培养瓶底面积80%左右时进行传代培养。以105/mL浓度接种于25 cm2的培养瓶中，24 h待细胞贴壁后细胞处于对数生长期时给药，使TSA终浓度分别为25 、50 、100 、200、400 nmol/L，加入最大溶解剂量的DMSO为对照组［DMSO浓度小于0.1%(V/V)，对细胞生长无影响］。
在药物处理后48 h后取出培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄记录细胞形态。
取对数生长期的细胞按1×105/L接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μL，实验组分别加入不同浓度的TSA 20 μL (终浓度分别为25、50、100、200、400 nmol/L)，对照组加入最大溶解剂量的DMSO，每组设8个平行孔。置于37 ℃培养箱内培养，作用48 h后，每孔加入20 μl MTT液(5 g/L，以PBS缓冲液配制)，继续培养4 h后，弃上清，每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，震荡10 min，用DG-3033型酶联免疫检测仪测定490 nm吸光度(A)值。用下面的公式计算抑制率。抑制率(％)=(1-实验组A 值/对照组A)×100%。
取对数生长期的细胞按1×106/L接种于24孔细胞培养板中，TSA作用48 h后，取出培养板，去除培养液，用PBS洗细胞2～3次，95%酒精固定15～20 min，倒出酒精后用PBS再洗，加入1%冰醋酸作用30秒，倒出冰醋酸用PBS洗，用0.01%的吖啶橙染色15 min，倒出吖啶橙，用PBS洗后置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
不同浓度组的TSA作用48 h后，取出培养瓶，去除培养液，加入2 mL消化液消化1 min左右，加入5 mL培养液，用吸管反复吹打成单细胞悬液，记数后收集细胞于离心管中，1 000 rmp离心5 min，参照试剂盒说明，用4 ℃预冷的PBS洗细胞2次，将细胞重悬于250 μL BindingBuffer，调节其浓度为106/mL，取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL、20 μg/mL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入400 μL PBS后上流式细胞仪检测。