摘要： 目的 探讨脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响。方法 将细胞接种于盖玻片上，细胞单层汇合后进行实验。实验分组：LPS组(用10μg/ml LPS)，LPS+山莨菪碱组(用10μg/ml LPS+10μg/ml山莨菪碱)，TNFα组(用5000u/mlTNFα)，TNFα+山莨菪碱组(用5000u/ml TNFα+10μg/ml山莨菪碱)，正常对照组加等量稀释液。作用15、90min后按照试剂盒提供的方法，并参照文献测定[Ca2+]i。结果 与正常对照组比较，LPS组、LPS+山莨菪碱组15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P< 0.01);LPS组与LPS+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P>0.05)。同样，与正常对照组比较，TNFα组、TNFα+山莨菪碱组15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P< 0.01);TNFα组与TNFα+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P>0.05)。结论 LPS、TNFα作用可使RPMVEC [Ca2+]i显著升高，山莨菪碱对LPS、TNFα诱导的RPMVEC [Ca2+]i升高无显著抑制作用;LPS、TNFα引起的[Ca2+]i浓度升高与β-AR介导的信号转导通路无关;[Ca2+]i升高可能参与了G蛋白偶联受激酶的活性调节。
关键词：内皮细胞;游离钙;脂多糖;肿瘤坏死因子α
1 材料与方法
1.2 LPS和TNFα对RPMVEC [Ca2+]i的影响 根据试剂盒说明书和文献介绍的方法进行。将细胞制成悬液接种于盖玻片上，细胞单层汇合后换含0.1%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h，使其处于静止状态。实验分组：LPS组加10μg/mlLPS，LPS+山莨菪碱组加10μg/mlLPS+10μg/ml山莨菪碱，TNFα组加5000u/mlTNFα，TNFα+山莨菪碱组加5000u/mlTNFα+10μg/ml山莨菪碱(均用含0.1%FBS的DMEM培养基稀释)，正常对照组加等量稀释液(各组n=4)。作用15、90min后于含fura-2/AM(5μmol/L)的PSS液中37℃孵育1h。漂洗后在LS-50B型荧光分光光度计上用双波长比例测量法检测，激发波长为340nm和380nm，发射波长为500nm，根据公式[Ca2+]i(nmol/L)= Kd×[(R-Rmin)/(Rmax-R)]×β计算钙离子浓度。公式中Kd为fura-2对Ca2+的解离常数，37℃时为224nmol/L;R为各样本在340nm和380nm的荧光强度的比值;Rmin为最小荧光比值，由加入高于Ca2+浓度(2～3倍)的EDTA后测得;R max为最大荧光比值，由加入终浓度为0.1%的Triton-X100后测得;β为380nm时fura-2在零钙和饱和钙条件下的荧光强度比值。
2 结 果
0.05)。表1 LPS对RPMVEC[Ca2+]i的影响*、**、Δ、ΔΔvs control，P< 0.01;*vsΔ，P>0.05;ΔΔvs**，P>0.05 (n=4)
0.05)。表2 TNFα对RPMVEC[Ca2+]i的影响*、**、Δ、ΔΔvs control,P< 0.01;*vsΔ，P>0.05;ΔΔvs ** ，P>0.05 (n=4)
影响细胞内游离钙浓度的因素主要有细胞外液的钙离子浓度和细胞内钙库。正常情况下，由于细胞膜上Ca2+-ATP酶的作用，细胞内游离钙能够保持较低浓度。内皮细胞的许多功能活动与细胞内游离钙浓度变化有关，内皮细胞活化后产生和分泌的许多血管活性物质又具有钙离子敏感性和钙离子依赖性，两者互为条件，互为因果。
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